ウエスタンブロットを行って二次抗体反応をが終了したらそれを検出する必要があります。
一般的にペルオキシダーゼ標識した２次抗体を使って化学発光していることが多いと思います。
今回はそんなECL溶液の作り方です。
購入している方も多いかと思いますが、一応手作りできるので参考までに
ECL法の原理
大まかに以下の図の通り
HRPがH2O2による基質の酸化を触媒する
ルミノール反応はアルカリ溶液中で起こる
PCAがルミノールのエンハンサーとして機能する。光の放出力、放出時間が強く、長くなる。エンハンサーによって発光強度が異なる
HRPは中性付近のpHで最適に機能する
ECL溶液のレシピ (例)
| ECL 1液 | ECL 2液 |
| 1M tris HCL pH8.5 ５ｍL 250mM in DMSO luminol 500uL 90mM in DMSO PCA (パラクマル酸) 220uL dH2O 50mLまでメスアップ | 1M tris HCL pH8.5 5mL H2O2 (sigma 216763) 32uL dH2O 50mLまでメスアップ |
HRP基質の信号持続時間は約24時間
1液と２液を混ぜて保存してしまうと、ずっとルミノールの酸化が進んでずっと発光する
luminol液は
3-aminophthahydrazide (Applichem A2185) 0.88g /20mL DMSO で250mMに調整して-20℃に分注して保存
PCAは
パラクマル酸 (sigma C9008-5G) 0.3g/20mL DMSO で90mMに調整、-20℃に分注して保存
参考
その他リンク
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